两种海洋双壳贝类凝集素及其抑菌机制的研究

【摘要】海洋双壳贝类属于无脊椎动物,因其不具有脊椎动物的免疫系统,所以自身形成了独特的天然免疫系统,而凝集素是它重要的天然免疫分子之一。在复杂的海洋环境中,双壳贝类产生了多种糖特异性各异的具有特定生理活性的凝集素。已经发现双壳贝类凝集素具有的抑菌作用,表明其可以成为潜在的抗菌物质来源。本文采用了CelluloseDE52、SephadexG-100以及HPLC等分离手段,从青蛤血淋巴中分离鉴定出一种新的能结合酵母的Ca2+依赖型凝集素(CSL),其分子量为72kDa,含有18及40kDa亚基。在自然状态下,为非聚集状态的单一分子。它的18kDa亚基的N-末端序列为AKPYDDAKYD。该凝集素经过胰蛋白酶消化并通过nano-ESI-MS/MS分析,得到YVAEEADR、LAITEVDLER、ENALDKAEQLEQKSIADDDRIDQLEK和EVDRLEDELLAEK等5个短肽序列。N-末端序列及5个短肽序列与其它海洋双壳贝类凝集素不具有同源性。CSL富含酸性氨基酸Asx和Glx,而Met、Phe和Tyr含量较少,总糖含量为16.2%。CSL的寡糖链与肽链之间的连接方式为O-糖苷键。该凝集素在0-40℃具有较高的血凝活性。在pH6-7时血凝活性稳定。D-甘露糖(D-Man)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)对其血凝活性具有抑制作用。CSL具有凝集大肠杆菌(Escherichiacoli)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的作用,对酵母细胞的凝集作用可被D-Man抑制。通过CelluloseDE52、SephadexG-100及HPLC等分离手段从菲律宾蛤仔中分离出一种菲律宾蛤仔凝集素(MCL-T),其分子量为148kDa,含有62和36kDa亚基。GalNAc和猪胃黏蛋白(Mucinfromporcinestomach,PSM)对其血凝活性具有抑制作用。MCL-T经过胰蛋白酶消化并通过nano-ESI-MS/MS分析,得到的6个短肽序列,分别为VQRVTMD、MAPGFVNNK、NAIFYVDVDK、ERVHPPRPGLQR、AKIDMASPFIVMR和IDMASPFIVMRDPVLYR。它的分子量及6个短肽序列与已经报道的菲律宾蛤仔凝集素不同,因此它是一种新的菲律宾蛤仔凝集素。MCL-T在0-40℃具有较高的血凝活性。在pH5-8时其血凝活性稳定。MCL-T具有凝集HCl处理的E.coli、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)及希瓦氏菌(Shewanellasp.)的作用,不凝集天然状态的E.coli、S.aureus、C.perfringens、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)及Shewanellasp.。研究了CSL、MCL-T以及贻贝凝集素(Crenomytilusgrayanuslectin,CGL)等三种贝类凝集素的抑菌活性。CSL对E.coli、C.perfringens和B.subtilis具有抑菌活性。呼吸抑制测试表明,CSL抑制E.coli和C.perfringens的EMP以及B.subtilis的HMP。CSL与E.coli,C.perfringens、B.subtilis共培养时,随着CSL浓度的增加,这三种细菌的DNA、RNA、可溶性蛋白均呈下降趋势,它们产生的NO的量呈现先升高后降低的趋势。MCL-T对S.aureus、B.subtilis和Shewanellasp.具有抑菌活性。呼吸抑制测试表明,MCL-T抑制S.aureus和B.subtilis的HMP以及Shewanellasp的TCA循环。MCL-T与B.subtilis、S.aureus、Shewanellasp.共培养时,随着MCL-T浓度的增加,B.subtilis和S.aureus的DNA、三种细菌的RNA和可溶性蛋白均呈下降趋势,这三种细菌产生的NO量呈现先升高后降低的趋势。CGL对E.coli、B.subtilis和Shewanellasp.具有抑菌活性。呼吸抑制测试表明,CGL抑制E.coli的TCA循环、Shewanellasp.的HMP以及B.subtilis的EMP。CGL与E.coli、Shewanellasp和B.subtilis共培养时,随着CGL浓度的增加,Shewanellasp和B.subtilis的DNA、三种细菌的RNA和可溶性蛋白均呈下降趋势,三种细菌产生的NO的量呈现先升高后降低的趋势。研究了MCL-T与S.aureus外膜蛋白(outermembraneproteins,OMP)的相互作用,发现两者可以结合且具有浓度依赖关系。同时,MCL-T与S.aureusOMP的结合受到PSM和GalNAc的抑制。并发现CSL、MCL-T和CGL等三种凝集素具有的RNase活性。细菌细胞内ATP检测结果表明,贝类凝集素发挥抑菌机制时,没有造成细胞内ATP的泄漏。扫描电镜(scanningelectronmicroscope,SEM)观察发现,CSL、MCL-T和CGL等三种凝集素不是通过使细菌细胞破裂而导致其死亡的。结果表明MCL-T具有与S.aureusOMP结合的结构域以及RNase活性结构域,CSL和CGL具有RNase活性结构域。本文发现新的贝类凝集素青蛤凝集素(CSL)与菲律宾蛤仔凝集素(MCL-T),对其结构、物理化学特性以及糖特异性进行了研究,并研究了三种双壳贝类凝集素CSL、MCL-T以及CGL的抑菌机制,为实现其应用奠定了基础。
【作者】佟长青；
【导师】李伟；
【作者基本信息】东北林业大学，细胞生物学，2013，博士
【关键词】青蛤凝集素；菲律宾蛤仔凝集素；结构域；抑菌活性；抑菌机制；

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